생물 반응기 환경을 위한 광학 O2 및 pH 센서
센서 재료 및 광전자 공학의 진보는 생명 과학, 의약품, 생명 공학 등의 분야에서 새로운 광학 센서를 구현할 수있게되었습니다. 갈바니 센서와 같은 전기 화학적 감지 기술과 비교할 때 광학 센서는 작고 사용자 정의 할 수있는 폼 팩터로 만들 수 있으며 방해가없는 측정을 허용하고 샘플을 소비하지 않습니다. 작동의 원리는 섬유의 팁, 패치와 같은 접착 멤브레인에 적용되는 호스트 매트릭스 (산소 용 폴리머 및 졸 - 겔 용 폴리머)에 산소에 민감한 형광 물질 또는 pH 지시약을 가두는 것이고, 또는 마이크로 타이 터 플레이트와 같은 편평한 기판에 적용될 수있다. 지표 물질은 특정 분석 물에 응답하여 광학 특성을 변화시키고 전자 장치는 반응을 측정합니다. 산소의 경우, 단계 형광 측정기는 용해 된 또는 가스 상태의 산소의 부분 압력을 측정합니다. pH의 경우, 소형 분광기는 pH 염료의 비색 (흡광도) 반응을 측정합니다.
바이오 리액터 환경에서 생물학적 파라미터를 모니터링하기위한 광학 산소 및 pH 센서의 생존 가능성을 입증하기 위해 바이오 플라스크 내부에 산소 및 pH 민감성 접착제 패치를 배치하여 대장균 발효 반응 동안 조건을 모니터링했습니다. 생물 반응기는 최종 생성물을 합성하기 위해 특정 조건 하에서 세포가 배양되는 폐쇄 환경 시스템입니다. 이러한 시스템은 생물 공정을 최적화하기 위해 DO 및 pH를 지속적으로 모니터링해야합니다. 광학 센서는 바이오 리액터의 액상에서 산소와 pH 측정을 제공하기 위해 사용되었습니다.
대장균 발효 과정 모니터링
재조합 단백질 및 기타 생성물의 생산을위한 대장균의 발효는 배양 조건의 엄격한 제어가 요구되는 복잡한 다단계 공정이다. 바이오 리액터에서 최적의 발효가 이루어지기 위해서는 산소와 pH 수준이 좁은 범위 내에서 유지되어야합니다. 박테리아 세포는 복제 할 때 산소를 소비하므로 필요에 따라 배양 물에 산소를 뿌려야합니다. 또한 박테리아 세포는 성장 과정에서 대사성 부산물을 방출하여 pH 수준을 주기적으로 재조정해야합니다. 고 수율을 보장하기위한 최적의 조건을 유지하려면 반응 중에 실시간으로 산소와 pH를 자주 모니터링해야합니다. 갈바니 센서, 상자성 센서, 연료 전지 센서 및 종이와 같은 산소 및 pH 측정을위한 다양한 기술이 존재합니다. 그러나 이러한 모든 기술은 침입 적이며 문화를 샘플링하거나 프로브 또는 센서를 반응기 용기에 넣어야 오염이 생기거나 성장 조건이 변경 될 수 있습니다.
광 센서는보다 비 침습적 인 모니터링 방법에 대한 비접촉식 대안을 제공합니다. 형광 물질은 생물 반응기의 액체 및 헤드 스페이스 단계에서 산소를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 용해 된 또는 가스 상태의 산소의 부분 압력은 청색 LED의 여기 신호와 형광의 방출 신호 사이의 위상 변화를 측정하기 위해 위상 형광 측정기를 사용하여 모니터링됩니다. 액상에서의 비 침습적 인 pH 모니터링은 소형 분광기를 사용하여 pH 염료의 비색 반응을 측정함으로써 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 비율에 비례하고 드리프트에 비교적 영향을받지 않습니다. 비색계 pH 센서는 또한 용액 색상, 침전물 또는 탁도의 영향을받지 않는 반사 센서로 구현 될 수 있습니다.
전형적으로, 반사 형 pH 및 산소 센서는 a) 산소 감지를위한 타겟 - 감응 형광체 또는 b) pH 감지 용 표시기 염료로 졸 겔 호스트 매트릭스의 얇은 시트를 도핑함으로써 형성된 활성 센서 층으로 구성된 패치를 포함한다. 일부 pH 센서에서 금도금은 반사율을 향상시키고 투과 수준, 기공 크기, 두께 및 기타 매개 변수에 맞게 사용자 정의 할 수 있습니다. 도 1에 도시 된 바와 같이, pH 센서 층은이 메쉬 층과 패치가 용기 벽에 부착 될 수있게하는 접착제 층 사이에 샌드위치된다. 산소 센서 패치는 열악한 환경에서보다 견고하게 만들기 위해 맨 손으로 남겨 두거나 실리콘 외장으로 코팅 할 수 있습니다.
산소, pH의 실시간, 비 침습적 모니터링
대장균 발효 중 액상의 산소와 pH를 모니터링하기 위해 산소와 pH에 민감한 접착 패치를 바이오 플라스크 안에 넣었다. 이러한 측정에 사용 된 설정이 그림 2에 나와 있습니다. 발효 반응은 LB 브로 쓰 성장 배지에서 실온에서 하룻밤 동안 성장시킨 Agilent Technologies의 E. coli AG1 Competent Cells를 사용하여 수행 하였다. 글루코스, 마그네슘 및 티아민이 보충 된 대장균 K12 성장 배지를 발효 반응 매질로 사용 하였다. 발효 반응을 시작하기 위해 기하 급수적으로 성장하는 E. coli 세포를 K12 성장 배지와 영양소가 함유 된 바이오 플라스크에 넣었다.
그림 2 :이 바이오 플라스크 설정에서 우리는 대장균 발효 중 바이오 리액터의 변화를 모니터링하기 위해 산소 민감성 및 pH 민감성 패치를 사용했습니다.
RedEye® 산소 패치와 pH 패치는 바이오 플라스크의 내벽에 적용되었습니다. 산소 패치는 바이오 플라스크의 액상에서 산소를 모니터링하기 위해 컨테이너에 부착되었습니다 (패치는 원할 경우 헤드 스페이스에 배치 할 수도 있음). pH 패치는 교정에 필요한 완충액의 양을 최소화하기 위해 바이오 플라스크의 바닥 근처에 두었다. 산소는 RedEye 패치의 형광 검출 및 검출을 위해 두 갈래 광섬유가 장착 된 위상 형광 측정기로 측정되었습니다. 바이오 플라스크에 성장 배지를 첨가하기 전에, RedEye 패치는 0 %와 20.9 %에서 보정되었습니다. 섬유는 플라스크의 외부 표면에 수직으로 위치하여 플라스크 내부의 패치를 직접 가리킨다. pH는 통합 된 텅스텐 할로겐 광원 및 두 갈래로 갈라진 광섬유가있는 소형 분광계를 사용하여 측정되었습니다. 섬유의 한쪽 다리는 용기 안쪽의 패치에 빛을 전달하고 다른 쪽 다리는 용액 안의 반사 패치에서 응답을 읽습니다. 표준 pH 버퍼는 보정을 위해 사용되었습니다. 시간에 따라 흡광도 곡선이 관찰되었습니다.
Results
산소 소비량은 세포가 영양분이 추가 된 신선한 배양 배지에 첨가 된 후에 세포 성장이 증가함에 따라 측정의 처음 두 시간 동안 가장 빨랐다. 발효 과정의 다음 6 시간 동안 산소 소모가 끝나고 안정화되기 시작했습니다 (그림 3). 발효 반응이 완전히 통제 된 환경에서 이루어지지 않았기 때문에, 처리의 밤 시간 (8-18 시간) 동안 관찰 된 변화는 주위 환경의 변동에 의해 야기 될 수있다.
그림 3 : 대장균 발효 중 산소 소비량은 반응 첫 두 시간 동안 가장 빨랐으며 다음 6 시간 동안 안정화되었습니다.
그림 4에서 볼 수 있듯이 21 시간의 실험 과정에서 pH는 세포 성장이 증가함에 따라 떨어지면서 새로운 배지 및 영양소에 노출되어 자극을받습니다. 증가 된 세포 성장으로 인해 유산과 같은 대사 부산물이 생성되기 때문에 pH가 떨어졌습니다. 측정 8 시간에서 14 시간 사이에 관찰 된 pH의 더 큰 저하는 온도가 세포의 최적 성장 조건에 도달함에 따라 세포 성장을 증가시키는 주변 온도 증가의 함수 일 수 있습니다. 발효 과정이 끝날 때 관찰 된 pH 변화의 꼬리 끌림 현상은 배양 물에 젖산 축적으로 인한 세포 독성 및 중요한 배양 배지 성분의 고갈로 인해 세포 성장이 느려졌 기 때문일 가능성이 높습니다.
그림 4 : 대장균 발효 실험이 진행됨에 따라 주위 온도와 젖산의 증가로 pH가 떨어지기 시작했다.
Conclusions
전기 화학 기반 산소 및 pH 감지의 한계는 오션 옵틱스 (Ocean Optics)의 광학 산소 및 pH 패치에 의해 극복되었습니다. 이러한 패치는 바이오 플라스 크 (bioflask)와 같은 소규모 생물 시스템 내에서 쉽게 통합 될 수 있으며 핵심 시스템 매개 변수에 대한 지속적이고 방해가없는 모니터링을 제공합니다. 밀폐 된 환경을 교란시키지 않으면 서 DO와 pH를 실시간으로 모니터링 할 수있는 능력은 생물 반응기의 공정에 대한 이해를 높이고 궁극적으로 새로운 생물학적 제품과 공정의 개발을 용이하게합니다.